Tlamati, Volumen 6, Número 10. Enero-Junio 2015
ISSN: 2007-2066
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Doi.
Artículo de Investigación
Influencia de HgCl2 en la expresión de fibrilarina (Fb) en germinación de
Phaseolus vulgaris L
Influence of HgCl2 on the expression of fibrillarin (Fb) in germination of Phaseolus
vulgaris L
Influência do HgCl2 na expressão da fibrilarina (Fb) na germinação de Phaseolus
vulgaris L
Josefina Huerta García1* ID. 0000-0002-5091-2791
Edgar León Esparza Ibarra1 ID. 0000-0002-6037-3998
Francisco Javier Cabral Arellano1 ID. 0000-0001-8530-9936
Lucía Delgadillo Ruiz1 ID. 0000-0002-6640-2753
1 Universidad Autónoma de Zacatecas. Unidad Académica de Ciencias Biológicas, Laboratorio de Biotecnología y Ciencias
Ambientales. Av. Preparatoria s/n. Col. Hidráulica C.P. 98000.
*Autor de correspondencia: jhuga@msn.com
Recibido: 09/01/2015
Revisado:21/03/2015
Aprobado: 28/05/2015
Publicado. 22/06/2015
Resumen
El mercurio (Hg) es considerado en la actualidad un contaminante ambiental de alto riesgo para la salud humana y
el medio ambiente. La toxicidad del Hg y sus compuestos ha sido documentada ampliamente, sin embargo los meca-
nismos moleculares de su toxicidad no han sido del todo clarificados. El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto
de cloruro de mercurio (HgCl2) en la expresión de Fb, como un biomarcador de efecto temprano de contaminación por
mercurio, utilizando como modelo semillas de Phaseolus vulgaris L., variedad negro Jamapa. Fibrilarina (Fb) uno de
los principales componentes del nucléolo, es una ribonucleoproteína conservada filogenéticamente, esencial en
procesamiento de RNA ribosomal (RNAr) en asociación con pequeños RNAs nucleolares (snoRNAs), además de otras
funciones básicas en los sistemas biológicos. La expresión de Fb fue monitoreada a través de electroforesis de proteínas
(PAGE-SDS) y Western blot en embriones de frijol durante etapas tempranas de germinación con diferentes tiempos 0,
6, 12, 18, 24 y 30 hrs y con una exposición de 10, 20 y 30 µM de HgCl2. Los resultados obtenidos por Western blot
revelaron que el mercurio inhibe la expresión de la proteína nucleolar Fb a partir de una concentración mínima de 10
µM de HgCl2 después de 18 horas de iniciada la germinación. Estas observaciones demuestran que la proteína suele ser
una molécula blanco de mercurio capaz de inhibir su expresión. Esta particular selectividad de HgCl2 por la proteína
pudiera constituir las bases bioquímicas para considerar a Fb como biomarcador temprano de contaminación por HgCl2.
Adicionalmente los resultados muestran que el HgCl2 provocó una clara inhibición y retra- so de la germinación de las
semillas de manera paulatina, conforme se aumentó la dosis de mercurio hasta 30 µM de HgCl2 . El presente estudio
describe por primera vez la presencia de Fb en Phaseolus vulgaris L., y el efecto del mer- curio en su expresión.
Palabras Clave: Fibrilarina, Cloruro de mercurio, Western Blot, proteínas, germinación
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Abstract
Mercury (Hg) is now considered an environmental contaminant of high risk to human health and the environment.
The toxicity of mercury and its compounds has been extensively documented, but the molecular mechanisms of tox-
icity have not been fully clarified. The aim of this study was to analyze the effect of mercuric chloride (HgCl2) in the
expression of Fb, as a biomarker of early effect of mercury contamination, using as a model of Phaseolus vulgaris L.
seeds, black variety Jamapa . Fibrillarin (Fb) one of the main components of the nucleolus, is an essential ribonucleo-
protein phylogenetically conserved in ribosomal RNA processing (rRNA) in partnership with small nucleolar RNAs
(snoRNAs), along with other basic functions in biological systems. The expression of Fb was monitored by protein
electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot of embryos beans during early stages of germination with different
times 0, 6, 12, 18, 24 and 30 hrs and exposure 10 , 20 and 30 µM HgCl2. The results obtained by Western blot re- vealed
that inhibits mercury nucleolar protein expression Fb from a minimum concentration of 10 µM HgCl2 after 18 hours
after the start of germination. These observations demonstrate that the protein is usually a mercury target mole- cule
capable of inhibiting its expression. This particular selectivity of HgCl2 by protein may constitute the biochemi- cal
basis for considering Fb as early biomarker of contamination by HgCl2 Additionally the results show that the inhi-
bition HgCl2 and caused marked delay seed germination gradually, as the dose of mercury is increased to 30 µM HgCl2.
The present study describes for the first time the presence of Fb in Phaseolus vulgaris L. and the effect of mer- cury in
their expression.
Keywords: Fibrilarin, Mercuric chloride, Western blot, proteins, germination
Resumo
O mercúrio (Hg) é atualmente considerado um contaminante ambiental de alto risco para a saúde humana e o meio ambiente. A
toxicidade do Hg e seus compostos tem sido amplamente documentada; no entanto, os mecanismos moleculares de sua
toxicidade ainda não foram completamente esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do cloreto mercúrico
(HgCl2) na expressão da fibrilarina (Fb), como um biomarcador dos efeitos iniciais da contaminação por mercúrio, utilizando
sementes de Phaseolus vulgaris L., variedade Negro Jamapa, como modelo. A fibrilarina (Fb), um dos principais componentes
do nucléolo, é uma ribonucleoproteína filogeneticamente conservada, essencial para o processamento do RNA ribossômico
(rRNA) em associação com pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs), além de outras funções básicas em sistemas biológicos. A
expressão da proteína Fb foi monitorada por eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e Western blot em embriões de feijão
durante os estágios iniciais de germinação em diferentes tempos (0, 6, 12, 18, 24 e 30 horas) e com exposição a 10, 20 e 30 µM
de HgCl₂. Os resultados do Western blot revelaram que o mercúrio inibe a expressão da proteína nucleolar Fb a partir de uma
concentração mínima de 10 µM de HgCl₂ após 18 horas de germinação. Essas observações demonstram que a proteína é um
alvo comum do mercúrio, que pode inibir sua expressão. Essa seletividade específica do HgCl₂ pela proteína pode fornecer a
base bioquímica para considerar a Fb como um biomarcador precoce de contaminação por HgCl₂. Além disso, os resultados
mostram que o HgCl₂ causou uma clara inibição e um atraso gradual na germinação das sementes à medida que a dose de
mercúrio foi aumentada para 30 µM de HgCl₂. Este estudo descreve pela primeira vez a presença de Fb em Phaseolus vulgaris
L. e o efeito do mercúrio em sua expressão.
Palavras-chave: Fibrilarina, Cloreto mercúrico, Western blot, proteínas, germinação
Introducción
Con el advenimiento del desarrollo industrial y minero,
la contaminación ambiental se ha incrementado en las últi-
mas décadas, siendo los metales pesados (MP) uno de los
principales contaminantes cuya toxicidad implica múltiples
efectos negativos sobre la salud de los seres vivos, inclu-
yendo al ser humano. El ser humano es más sensible a la
presencia de MP que las plantas, las cuales son capaces de
acumular elementos metálicos en sus tejidos y órganos con
cierta tolerancia (Sipter, Auerbach, Katalin y Mathe-
Gaspar, 2009). El principal problema de los metales pesa-
dos es su bioacumulación y que no son biodegradables, por
tanto representan un riesgo permanente para la salud y el
medio ambiente (Pirrone, Costa, Pacyna y Ferrara, 2001).
El mercurio (Hg) por sus propiedades físicas y quími-
cas únicas ha sido identificado como una sustancia tóxica
persistente y bioacumulable (STPB). El Consejo de Admi-
nistración del Programa de las Naciones Unidas para el
Medio Ambiente (Programa de las Naciones Unidas para el
Medio Ambiente [PNUMA], 2002) propone que existen
pruebas suficientes de efectos adversos significativos de este
elemento tanto en la salud como en el ambiente, por lo cual lo
declara como una seria amenaza global.
Los efectos de mercurio nivel bioquímico muestran una alta
afinidad para unirse a diversos grupos funcionales
principalmente grupos sulfhidrilo (-SH), provocando pro-
fundas modificaciones metabólicas que incluso pueden
conllevar a muerte celular (García y Reyes 2001) A nivel
genético el Hg altera la fidelidad de duplicación del DNA
además de interferir con la asociación de proteínas histo- nas,
lo que conlleva a mutagénesis, esto explica las aberra- ciones
cromosómicas y anomalías congénitas observadas durante las
intoxicaciones alimentarias con mercurio (Schurz, Vilar y
Gremmels, 2000; Patra, Bhowmik, Ban- dopadhyay y Sharma,
2004).
Fibrilarina (Fb) es una proteína conservada filogenética-
mente, esencial en procesamiento de RNAr en asociación
con snoRNAs (Baserga, Yang y Steitz, 1991). La literatura
reporta que Fb suele ser molécula blanco de Hg, dicha aso-
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ciación no es muy clara, sin embargo estudios reportan
que el HgCl2 provoca una modificación de las
propiedades mo- leculares y funcionales de la proteína
(Pollard, Lee, Ca- siano, Bluthner, Johnston y Tan, 1997;
Pollard, Pearson yTan, 2000). Los grupos -SH forman
parte estructural del aminoácido cisteína que se encuentra
incorporado a centros activos de enzimas por lo que su
bloqueo por este metal pesado resulta en una
disminución o eliminación de sus actividades catalíticas.
Las investigaciones reportan que Fb es una proteína
involucrada en una serie de funciones bio- lógicas
básicas, además de presentar actividades enzimáti- cas.
En base a esto, es razonable suponer que la unión de
HgCl2 desestabiliza los enlaces --SH intramoleculares, lo
que resulta en alteración de la estructura tridimensional
de Fb que induce la generación de epítopes crípticos que
esti- mulan su degradación por proteosomas (Chen y von
Mi- kecz, 2005).
Una característica en la estructura primaria de Fb
tanto en animales como en plantas (Arabidopsis
thaliana), es la presencia de dos a cuatro residuos de
cisteína, los cuales parecen ser el sitio directo de
interacción con el Hg (Pollard et al. 1997). El comprender
las interacciones intramolecula- res entre los grupos -SH
de la cisteína tiene suma importan- cia no solamente para
entender el papel funcional de Fb, sino también para
clarificar la afinidad que tiene el mercu- rio hacia Fb
(Takeuchi, Rothe y Goeddel, 1996).
El objetivo del presente estudio, fue evaluar el efecto
de HgCl2 en la expresión de Fb en embriones de
Phaseolus vulgaris L., durante etapas tempranas de
germinación, que puede ser utilizado como un posible
biomarcador de conta- minación por Hg.
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Figura 1. Germinación grupo Testigo (sin HgCl2) : A - 0 hrs; B – 6 hrs; C -12 hrs; D -18 hrs; E - 24 hrs Inicio de germina-
ción / 2 semillas y F -30 hrs/ 4 semillas germinaron
Materiales y métodos
Germinación de semillas de Frijol Negro Jamapa. Se
pesaron 15 gramos de semillas de frijol, se aplicó un trata-
miento breve de esterilización superficial de la semillas por
inmersión en hipoclorito de sodio al 1%, por 3 minutos,
seguido de tres lavados de agua destilada estéril por 3 mi-
nutos c/u. (Wilson, 1915). Posteriormente se colocaron en
cajas petri que contenían 3 discos de papel absorbente esté-
ril, siendo cubiertas con un disco del mismo papel, se les
agregó 25 ml de agua destilada estéril. La incubación se
llevó a cabo en condiciones controladas de humedad y
temperatura constante de 25º C, en una incubadora simple,
con diferentes tiempos de germinación (0, 6, 12, 18, 24 y 30
hrs.).Se estudiaron 2 grupos, uno sin HgCl2 (testigo) y tres
expuestos a diferentes concentraciones de
HgCl2.:tratamiento 1-10 µM de HgCl2, tratamiento II-20
µM de HgCl2 y tratamiento III-30 µM de HgCl2
(experimentales).
Extracción de proteínas solubles de embriones de fri-
jol. Una vez que se cumplieron los tiempos de germina-
ción, se procedió a la extracción de embriones de las semi-
llas de frijol, posteriormente se pesó la cantidad obtenida de
cada muestra y se sumergieron en nitrógeno líquido; y una
vez congelados se trituraron en un mortero de porcela- na
hasta obtener un polvo fino, al cual se le adicionó buffer de
extracción NET-2, 20 µl de buffer por µg de embrión
pulverizado, según lo describen Nambara, Naito y McCoort
(1992), luego se disolvió en agitador (vortex), y se
centrifugó a 6000 rpm por 5 minutos el sobrenadante se
transfirió a tubos eppendorf, se almacenaron en congela-
ción (-4ºC) hasta su cuantificación de proteínas solubles de
acuerdo a la técnica de micro Bradford (1976), todos los
ensayos se hicieron por triplicado.
Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida
(PAGE-SDS). Una vez obtenidos los extractos solubles se
procedió a la separación de proteínas obtenidas en base a su
peso molecular a través de PAGE-SDS, en condiciones
reductoras por el método descrito por Laemmli (1970). Para
lo cual se utilizó una minicamara de electroforesis dual Mini
protean II de Bio-Rad. Se prepararon los geles separador
(12%) y concentrador (4.5%). Se utilizaron 45 µg de
proteína por carril, las cuales fueron desnaturaliza- das con
buffer de muestra Laemmli (Tris-Cl 0.5 M, pH 6.8,
4.0 ml de SDS al 10%, 1.0 ml de Bis-mercaptoetanol, 8.0
ml de glicerol, 20 µl de azul de bromofenol al 1% y 4.5 ml
de agua destilada). Se colocaron las muestras en los pozos
del gel, y se agregó buffer de corrida, se corrió el gel a 100
volts constantes por aproximadamente 2 horas usando una
fuente de poder Power Pac de Bio Rad. Al término de la
electroforesis se tiñeron los geles para visualizar las bandas
de proteína con azul coomasie R-250. Se incluyeron mar-
cadores de peso molecular de 10-250 kDa (Bio-Rad).
Electrotransferencia de proteínas a papel de nitrocelu-
losa. Después de llevar a cabo la electroforesis se procedió
hacer la electrotransferencia de proteínas del corrimiento en
gel a membranas de nitrocelulosa de acuerdo a lo des- crito
por Towbin, Staehelin y Gordon (1979). En equipo semi dry
y con fuente de poder modelo pac 200 marca Bio- Rad, en
una corriente de 20 Volts por 30 minutos. Al ter-
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Grafica 1. Efecto de HgCl2 en concentración de proteínas (µg/µl) de embriones de frijol en etapas tempranas
de germinación (0, 6, 12, 18, 24 y 30 hrs): Testigo/sin HgCl2 (rojo); Tratamiento 10 µM de HgCl2 (azul); Tra-
tamiento 20 µM de HgCl2 (amarillo) y Tratamiento 30 µM de HgCl2 (verde).
Figura 2. Germinación Tratamiento 10 µM HgCl2: A - 0 hrs; B – 6 hrs; C -12 hrs; D -18 hrs; E - 24 hrs y F -30 hrs/ 2 se-
millas germinaron (flecha roja).
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mino de la transferencia el papel de nitrocelulosa se tiñó en
solución de fast green: 0.1 g de colorante (0.1%), 5 ml de
ácido acético (5%), 10 ml de metanol (10%), aforados a 100
ml con agua destilada. Después se retiró el colorante y se
lavó con agua destilada para verificar la transferencia de las
proteínas y se dejó secar el papel de nitrocelulosa
Western Blot. Después de transferir las proteína, a las
membranas de nitrocelulosa se sumergieron en solución de
PBS- leche 3% en agitación constante durante toda la no-
che. Para determinar la presencia de la proteína Fb de 34
kDa mediante reactividad del anticuerpo se incubó con el
autoanticuerpo anti-Fb de humano por 2 horas. Después se
repitieron 3 lavados con PBS-Tween 20 posteriormente se
incubó con un segundo anticuerpo anti-IgG humana cade-
na gamma específica conjugada con peroxidasa por 2 ho-
ras. Por último la reacción antígeno-anticuerpo se reveló
con el compuesto 3-3, Diamino Bencidina en presencia del
catalizador Peróxido de Hidrogeno (Towbin y Gordon,
1984).
Densitometría. Las imágenes de las bandas de proteína
obtenidas por Western blot, fueron capturadas en un foto-
documentador ChemiDoc XRS + marca Bio-Rad. Luego se
sometieron a un análisis densitométrico cuantitativo, con el
sofware Quanty One de marca Bio-Rad versión 2.01.
Resultados
Los resultados obtenidos de las semillas expuestas a
diferentes tratamientos de HgCl2 mostraron marcados efec-
tos de inhibición y retraso en el proceso de germinación a
partir de una concentración de 10 µM, este comportamien-
to se incrementó al ir aumentando la dosis a 20 µM, y cul-
minando con la muerte de las semillas a una concentración
de 30 µM de mercurio a las 102 hrs (dato no mostrado), en
comparación con el grupo testigo, como se observa en las
figuras 1, 2, 3 y 4.
Una vez que los diferentes tratamientos sobre las semi-
llas cumplieron los tiempos de germinación con los respec-
tivos tratamientos de HgCl2, se cuantificó la concentración
de proteínas por espectrofotometría en cada uno de los
grupos de estudio, observándose un buen rendimiento para
ser procesadas en PAGE-SDS. Los resultados que se
muestran en la Gráfica 1 nos permiten observar que la con-
centración de proteínas fue mayor en el grupo testigo, en
comparación con los tres tratamientos de HgCl2. Cada uno
de los grupos iniciaron con una alta concentración de pro-
teínas en semillas en dormancia (0 hrs), sin embargo una vez
que dio inicio el proceso de germinación se observa que la
exposición gradual de 10, 20 y 30 µM de HgCl2 va
disminuyendo la síntesis proteica, datos mostrados en la
Grafica 1, demostrando así el gran potencial que tiene el Hg
para inhibir la síntesis de proteínas solubles a través del
tiempo de germinación temprana (6, 12, 18, 24 y 30 hrs), en
presencia de mercurio.
Los resultados electroforéticos (véanse figuras 5 y 6)
mostraron perfiles proteicos diferenciales en la expresión de
bandas en cada uno de los grupos. El grupo testigo ex- presó
gran cantidad de bandas de proteínas en etapas tem- pranas
de germinación. Una de las bandas comunes que se
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Figura 3. Germinación Tratamiento 20 µM HgCl2: A - 0 hrs; B – 6 hrs; C -12 hrs; D -18 hrs; E - 24 hrs y F - 30 hrs.
Gráfica 2. Densitometría de Fb en embriones de frijol expuestos a HgCl2 en etapas tempranas de germinación (0 a 30 hrs).
Testigo/sin HgCl2 (rojo); Tratamiento 10 µM de HgCl2 (azul); Tratamiento 20 µM de HgCl2 (amarillo) y Tratamiento 30
µM de HgCl2 (verde).
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Figura 4. Germinación Tratamiento 30 µM HgCl2: A - 0 hrs; B – 6 hrs; C -12 hrs; D -18 hrs; E - 24 hrs y F -30 hrs
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identificó en todos los carriles fue una banda de aproxima-
damente 34-36 kDa. El tratamiento de 10 µM de HgCl2,
mostró una disminución de proteínas, a partir de 12 hrs
(carril 3) y vuelven a expresarse bandas que estaban pre-
sentes a las 6 hrs, para posteriormente en 24 y 30 hrs vol-
ver a inhibirse la expresión de una gran cantidad de proteí-
nas. Los Tratamientos de 20 µM de HgCl2 y 30 µM de
HgCl2 revelaron un descenso generalizado en la expresión
de proteínas (véase gráfica 1).
Los resultados de Western blot mostraron el reconoci-
miento molecular de la banda de Fb en embriones de frijol
en los diferentes tiempos de germinación en el grupo A
(testigo sin HgCl2) y en grupo B (10 µM de HgCl2) solo en
las primeras horas de germinación 6, 12 y 18 hrs se obser-
va la banda de Fb pero a las 24 hrs disminuye severamente
su expresión, inhibiéndose aún más a las 30 hrs (Figura 7).
En grupo C (20 µM de HgCl2) la banda es muy tenue du-
rante las primeras 6 y 12 hrs y por último en el grupo D (30
µM de HgCl2) no se observa ninguna banda (véase figura
8). Una vez que se identificó la banda de Fb (34/36 kDa)
por Western blot, en embriones de frijol expuestos a tres
tratamientos de HgCl2, se realizó el análisis de densitome-
tría, los cuales guardan correlación con los resultados en
ensayos de Western blot, presentando una disminución
gradual en la banda de interés conforme aumentó la dosis de
mercurio, datos mostrados en Gráfica 2.
Discusión y conclusiones
Los resultados obtenidos en el grupo testigo y grupos
experimentales con tres tratamientos de mercurio nos per-
miten inferir que este metal aún en cantidades mínimas de
10 µM altera, procesos fisiológicos y bioquímicos básicos
en las plantas que conllevan a inhibir y/o retardar la germi-
nación como se observa en las figuras 1, 2, 3 y 4, así como
a inhibir la síntesis de proteínas (véase gráfica 1) en etapas
tempranas de germinación y la expresión de Fb (véase
gráfica 2).
Los datos sobre concentración de proteínas indican el
comportamiento de los niveles de expresión proteica que
están siendo codificadas durante el proceso de germinación
y como estos perfiles de expresión son modulados en pre-
sencia de HgCl2 produciendo un descenso al ir incremen-
tándose la dosis de mercurio, a través de las diferentes
Figura 5. Electroforesis de proteínas de frijol en gel de poliacrilamida al 12% (A) Grupo Testigo (sin HgCl2) Ca-
rriles: M - P.M. (BIO-RAD); 1- 0hrs; 2- 6hrs; 3-12 hrs; 4-18hrs; 5-24 hrs y 6-30 hrs. (B) Tratamiento 10 µM de
HgCl2 Carriles: M - P.M.; 1- 0hrs; 2- 6hrs; 3-12hrs; 4-18hrs; 5-24hrs y 6-30 hrs.
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Figura 6. Electroforesis de proteínas de frijol en gel de poliacrilamida al 12% (C) Tratamiento 20 µM de HgCl2 Carriles 1-
6hrs; 2-12 hrs; 3-18hrs; 4-24 hrs y 5-30 hrs. (D) Tratamiento 30 µM de HgCl2 Carriles: 0hrs; 1- 6hrs; 2-12hrs; 3-18hrs; 4-
24hrs y 5-30 hrs.
etapas de germinación como se muestra en la gráfica 1, éstos
resultados concuerdan con estudios de Ericson y Al- finito
(1984) quienes proponen una baja concentración de
proteínas en plantas expuestas a mercurio, que coinciden a
su vez con los reportes de Costa y Spitz (1997) sobre la
disminución de proteínas solubles por exposición a meta-
les pesados. Por su parte Palma, Sandalio y Romero- Puertas
(2002) también sugieren que la disminución en el contenido
proteico resulta de un incremento de actividades
proteolíticas en respuesta a metales pesados.
Fibrilarina ha sido caracterizada en algunas especies de
plantas (Pih, Yi, Liang, Shin, Cho, Hwang y Son 2000;
Stepinski, 2009), sin embargo el presente estudio la reporta
por primera vez en Phaseolus vulgaris L., donde se mues-
tra que concentraciones mínimas de 10 µM HgCl2 inhibie-
ron su expresión después de 18 hrs de iniciado el proceso
germinativo. Esto tiene gran relevancia en base a lo que
reporta Chen, Rockel, Steinweger, Hemmerich, Risch y von
Mikecz (2002) sobre concentraciones de 5 µM de HgCl2 en
células animales es suficiente para inducir una
redistribución subcelular de Fb hacia proteosomas nucleo-
plasmicos donde es degradada, por tanto en base a los re-
sultados obtenidos en semillas de Phaseolus vulgaris L.,
podemos proponer un efecto similar en células vegetales,
con la diferencia que el efecto sobre Fb de plantas fue a
partir del Tratamiento I (10 µM de HgCl2), en el que el
tóxico provocó su proteólisis, lo que conllevó a inhibir su
expresión, en las subsiguientes horas, y como consecuen-
cia alteró de manera importante la homeostasis del proceso
germinativo de las semillas. Estos datos demuestran como
las células vegetales presentan mayores mecanismos de
tolerancia que las células animales (Barceló y Poschenrie-
der, 2003).
En células vegetales, no se encontraron reportes sobre el
efecto de HgCl2 a nivel de expresión molecular en eta- pas
tempranas de germinación, los trabajos disponibles en la
literatura científica se orientan sobre toxicidad en germi-
nación, crecimiento y desarrollo de plantas de cultivo prin-
cipalmente (Navarro, Arrieta y Maldonado, 2006), tampo-
co existen datos en literatura sobre el uso de un biomarca-
dor de contaminación por Hg en etapas tempranas de ger-
minación que involucren la expresión o inhibición de pro-
teínas como marcadores bioquímicos.
Los ensayos de Western blot, demostraron la reactivi-
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dad del suero humano anti-Fb en sistema de plantas reco-
nociendo el péptido de 34-36 kDa así como de otras ban-
das, esto comprueba la conservación evolutiva de Fb en
organismos eucariontes (Guiltinan, Schelling, Ehtesham,
Thomas y Christensen, 1988), lo que concuerda con repor-
tes de Cerdido y Medina (1995) quienes demuestran que
anticuerpos anti-Fb de humanos reconocen proteínas de 34
a 36 kDa en plantas. El anticuerpo policlonal de Fb huma-
na utilizado en esta investigación mostró reconocimiento
contra péptidos de embriones de frijol, con ello se demues-
tra la capacidad reactiva del anticuerpo en ambos sistemas
y de la presencia de antígenos equivalentes. Tal reconoci-
miento nos indica que el anticuerpo reconoce estructuras o
epítopes conservados en los diferentes sistemas biológicos.
Con tales resultados y para tener elementos en la inter-
pretación de los datos al revisar la literatura encontramos
reportes de Takeuchi et al. (1996), quienes citan que el
HgCl2 suele tener como blanco molecular a la proteína Fb,
el mecanismo por el cual el HgCl2 tiene gran selectividad
por esta molécula en particular, es aún incierto, Pollard et
al. (2000) sugieren que la interacción de Fb con HgCl2
puede ser través de los residuos de cisteínas, que presentan
grupos –SH, y por los cuales el mercurio muestra alta afi-
nidad, causando la desestabilización de la proteína que
induce a una muerte celular y esto trae como resultado la
alteración de una serie de eventos celulares y moleculares
básicos en los cuales participa Fb en sistemas biológicos,
así mismo Chen y von Mikecz (2005) han propuesto que la
unión de HgCl2 a Fb, altera la estructura tridimensional de
la proteína que estimula su degradación hacia proteoso-
mas.
Estos resultados permiten poner de manifiesto que la
asociación de Fb con el mercurio, provoca un cambio en su
estructura conformacional, y por tanto la perdida de su
funcionalidad que conlleva a la supresión de actividades
moleculares y fisiológicas básicas en las cuales está invo-
lucrada. Aún cuando la función de Fb estrictamente en
germinación, nunca ha sido reportada, los efectos observa-
dos en este estudio a concentraciones de 10 µM HgCl2 y su
corto tiempo de exposición (18 hrs) fue suficiente para
inhibir la expresión de la proteína (datos mostrados en
ensayos de Western blot), esto indica su gran potencial para
ser utilizada como biomarcador bioquímico de toxici- dad
por Hg.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de
HgCl2 en la expresión de Fb en embriones de Phaseolus
vulgaris L., durante la germinación, para considerar a Fb
una proteína nucleolar presente en humanos y plantas co-
Figura 7. Western blot de proteínas de frijol (A) Grupo Testigo ((sin HgCl2) Carriles: M - P.M. (BIO-RAD); 1- 0hrs;
2- 6hrs; 3-12 hrs; 4-18hrs; 5-24 hrs y 6-30 hrs. (B) Tratamiento 10 µM de HgCl2 Carriles: M -P.M.; 1- 0hrs; 2- 6hrs;
3-12hrs; 4-18hrs; 5-24hrs y 6-30 hrs. La flecha roja señala la banda de Fb (34-36 kDa).
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Figura 8. Western blot de proteínas de frijol (C) Tratamiento 20 µM de HgCl2 Carriles: M - P.M. (BIO-RAD); 1- 0hrs; 2-
6hrs; 3-12 hrs; 4-18hrs; 5-24 hrs y 6-30 hrs. (D) Tratamiento 30 µM de HgCl2 Carriles: M -P.M.; 1- 0hrs; 2- 6hrs; 3-12hrs;
4-18hrs; 5-24hrs y 6-30 hrs. La flecha roja señala la banda de Fb (34-36 kDa).
mo un posible biomarcador de contaminación por Hg.
En base a lo reportado anteriormente y a los objetivos
planteados en la Investigación podemos concluir lo si-
guiente
Se identificó la presencia de Fb por primera vez en Pha-
seolus vulgaris L., en etapas tempranas de germinación.
Se demostró que concentraciones mínimas de 10 µM de
HgCl2 suprimen la expresión de Fb después de 18 hrs de
exposición en semillas de frijol.
Podemos establecer por los resultados presentados en el
presente estudio que la expresión de la proteína Fb puede ser
considerada como un marcador bioquímico de contami-
nación por HgCl2.
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