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Tlamati, Volumen 6, Número 10. Enero-Junio 2015
ISSN: 2007-2066
Doi.
Artículo de investigación
Evaluación de los niveles de expresión de REST en líneas celulares de cáncer de
pulmón: uso potencial como herramienta de diagnóstico
Evaluation of REST expression levels in lung cancer cell lines: potential use as a
diagnostic tool
Avaliação dos níveis de expressão de REST em linhagens celulares de câncer de
pulmão: potencial uso como ferramenta diagnóstica.
Carlos Ortuño Pineda1* ID. 0000-0002-1757-1964
Ricardo Martínez Baltazar1 ID. 0009-0006-5992-5106
Adán Arizmendi Izazaga1 ID. 0000-0003-4068-3312
Jesús Emmanuel Molina Llamas1 ID. 0000-0003-1838-827X
Adela Sánchez Ocegueda1 ID. 0000-0001-9214-0913
Yurely Harrinson Mendoza1 ID. 0000-0003-2318-7755
Banessa del Rocío Vázquez Berra1 ID. 0000-0001-5367-3987
Amalia Vences Velázquez1 ID. 0000-0001-8810-1401
Jesús Valdés Flores2 ID. 0000-0003-1787-9229
1 Universidad Autónoma de Guerrero. Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas. Av. Lázaro
Cárdenas s/n. C.U. Zona Sur. C. P. 39087. Chilpancingo, Gro. México.
2 Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional.
*Autor de correspondencia: carlos2pineda@hotmail.com
Recibido: 07/01/2015
Revisado: 05/02/2015
Aprobado:08/04/2015
Publicado. 25/06//2015
Resumen
La agresividad del cáncer de células pequeñas de pulmón [SCLC, small cell lung cáncer] se asocia
con la habili- dad de las células cancerosas para la metástasis. Trabajos previos han demostrado el
papel de REST (RE-1 Silencing Transcription factor) en la regulación del fenotipo neuronal del SCLC,
evidenciando su importancia como blanco potencial en el diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue
determinar si existe expresión diferencial de REST entre líneas celulares provenientes de diferentes
etapas de SCLC, mediante el análisis de proteínas a través de western blot. Los resultados mostraron
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expresión diferencial de REST canónica en las diferentes líneas celulares, evidenciando disminución
de sus niveles, y aparición de tREST (truncated REST) en etapas avanzadas del cáncer. Estos estudios
constituyen una de las primeras evidencias de REST como potencial biomarcador del SCLC.
Palabras clave: REST, Biomarcador, SCLC, Evaluación, líneas celulares
Abstract
The aggressiveness of small cell lung cancer (SCLC) is associated with the ability of cancer cells to
metastasize. Previous studies have demonstrated the role of REST (RE-1 Silencing Transcription factor) in
regulating the neuronal phenotype of SCLC, highlighting its importance as a potential diagnostic target. The
aim of this study was to determine whether there is differential REST expression among cell lines from
different stages of SCLC, using protein analysis via Western blot. The results showed differential expression
of canonical REST in the different cell lines, demonstrating decreased levels and the appearance of truncated
REST (tREST) in advanced stages of cancer. These studies constitute some of the first evidence of REST
as a potential biomarker for SCLC.
Keywords: REST, Biomarker, SCLC, Evaluation, Cell lines
Resumo
A agressividade do câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) está associada à capacidade das células
cancerígenas de metastatizar. Estudos anteriores demonstraram o papel do REST (fator de transcrição
silenciador RE-1) na regulação do fenótipo neuronal do CPPC, destacando sua importância como um potencial
alvo diagnóstico. O objetivo deste estudo foi determinar se há expressão diferencial de REST entre linhagens
celulares de diferentes estágios do CPPC, utilizando análise proteica por Western blot. Os resultados
mostraram expressão diferencial do REST canônico nas diferentes linhagens celulares, demonstrando níveis
reduzidos e o aparecimento de REST truncado (tREST) em estágios avançados do câncer. Esses estudos
constituem algumas das primeiras evidências do REST como um potencial biomarcador para CPPC.
Palavras-chave: REST, Biomarcador, CPPC, Avaliação, Linhagens celulares
Como citar el artículo:
Ortuño Pineda, C., Martínez Baltazar, R., Arizmendi Izazaga, A., Molina Llamas, J. E.,
Sánchez Ocegueda, A. Harrinson Mendoza, Y., Vázquez Berra, B. del R., Vences Velázquez, A.
y Valdés Flores, J. (2015). Evaluación de los niveles de expresión de REST en líneas celulares
de cáncer de pulmón: uso potencial como herramienta de diagnóstico. Tlamati, 6(1), 5-9
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Introducción
El cáncer de pulmón (LC Lung Cancer)
representa el tumor maligno que más muertes
ocasiona a nivel mundial. En el 2010,
aproximadamente 1.4 millones de personas
murieron de cáncer de pulmón (Organización
Mundial de la Salud [OMS], 2010). En México se
encuentra dentro de las principales causas de
muerte en varones, solo superado por las
enfermedades cardiacas (Instituto Mexicano del
Seguro Social [IMSS], 2012). El LC se clasifica
en dos grandes grupos de acuerdo a sus
características histológi- cas: el SCLC (Small Cell
Lung Cancer) y el NSCLC (Non Small Cell Lung
Cancer). El SCLC es el más agresivo por presentar
un fenotipo neroendocrino, ser generalmente
asintomático y extremadamente difícil de
diagnosticar. Cuando se presentan síntomas, estos
pueden confundirse con los de otras enfermedades
de las vías respiratorias (Mayoral, M.A., Zenteno,
E., Espinosa, B., Martínez, S. y Guevara J., 2004).
REST es un regulador maestro que funciona
positiva- mente durante de la neurogénesis y es
esencial en el mante- nimiento de la plasticidad
neuronal. En tejidos no neurona- les REST
funciona de manera negativa silenciando genes
cuya expresión está restringida al sistema nervioso
(Ballas, N, Grunseich C., Lu D. D., Speh J. C. y
Mandel G., 2005). Interesantemente, el SCLC
presenta características neuro- endocrinas típicas,
como la presencia de péptidos cuya ex- presión se
restringe de manera natural a ciertas poblaciones
neuronales y que son regulados
transcripcionalmente por REST (Schoenherr, C. J.
y Anderson, D. J., 2005; Chong, J.A., Tapia-
Ramírez, J., Kim, S., Toledo-Aral, J.J., Zheng, Y.,
Boutros, M.C., Altshuller, Y.M., Frohman, M.A,
Kra- ner, S.D. y Mandel, G, 1995; Ballas, N,
Grunseich C., Lu
D. D., Speh J. C. y Mandel G., 2005; Coulson, J.
M., Edg- son, J. L., Woll, P. J. y Quinn, J. P.,
2000).
Nuestro grupo de estudio describió
recientemente la degradación de REST vía
proteosoma y la presencia de tREST en la línea
celular H69 de SCLC (Ortuño-Pineda, C.,
Galindo-Rosales, J. M., Calderón-Salinas, J. V.,
Ville- gas-Sepúlveda, N., Saucedo-Cárdenas, O.,
De Nova- Ocampo, M. y Valdés, J., 2012). Dichos
hallazgos han con- tribuido a entender el perfil
neuronal de este tipo de cáncer. Además, varias
isoformas de REST han sido relacionadas con
diversos tipos de cáncer en los últimos años
(Palm, K., Metsis, M. y Timmusk, T., 1999;
Fuller, G., Su, X., Price, R., Cohen, Z., Lang, D.,
Sawaya, R., y Majumder, S., 2005; Westbrook, T.
F., Martin, E. S., Schlabach, M. R., Leng, Y.,
Liang, A. C., Feng, B., Zhao, J. J…., 2005; Lv,
H., Pan, G., Zheng, G., Wu, X., Ren, H., Liu, Y. y
Wen, J., 2010). En este trabajo caracterizamos los
niveles de expre- sión y la localización celular de
las isoformas de REST en líneas celulares de
diferentes estadios del SCLC. Nuestros hallazgos
son nuevos y aportarán elementos para el mejor
entendimiento del fenotipo celular de esta
patología, ade- más de que proporciona las bases
para la búsqueda de nue-
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Figura 1. Isoformas de REST. La columna de la izquierda muestra el nombre
comúnmente usado de ca- da isoforma de REST. La columna del centro muestra los exones
(cajas grises) que constituyen a cada variante del mRNA. En cajas verdes se muestra la
inclusión aberrante del exón N, que introduce un codón de paro pre- maturo en el mRNA. La
pequeña caja roja en el exón V de REST-4 indica una mutación. En la columna de la derecha
se muestran las isoformas de REST con sus dominios funcionales representativos.
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vas moléculas para el diagnóstico oportuno del SCLC.
Materiales y métodos
Cultivos celulares. Se utilizaron las líneas celulares NCI-H1417, NCI-H69 (ATCC®) de SCLC,
A549
(ATCC® CCL-185™) de NSCLC y MRC-5 (células de pulmón no cancerosas). Todas fueron cultivadas
siguiendo las indicaciones de la ATCC, en placas de 100 mm de diá- metro en una estufa a 37 °C, a una
atmosfera de presión y una concentración de CO2 del 5%.
Obtención de extractos proteicos: nucleares y citoplas- máticos. Para las células adherentes, la
monocapa celular fue lavada con 3 ml de Buffer de despegado (40 mM de Tris HCl pH 7.5, 1 mM de
EDTA, 150 mM de NaCl) du- rante 5 min y posteriormente recuperada con ayuda de Scrapper. Las
células en suspensión fueron recuperadas por centrifugación a 1 500 rpm durante 10 minutos y lava- das
con buffer de despegado. Los extractos proteicos de las diferentes fracciones celulares fueron purificados
siguien- do el protocolo de Dignam (Dignam, 1990).
Cuantificación de proteínas por el método de Bradford.
La concentración de las proteínas fue determinada por elmétodo de Bradford. La mezcla de reacción
consistió de 900 µl de reactivo de Bradford (Biorad Quick Start™ Bradford Protein Assay Kit 1 500-
0201), 95 µl de agua mQ y 5 µl de la muestra proteica o el blanco. La muestra fue cuantificada dentro de
un rango no mayor a 15 min, a 590 nm en un espectrofotómetro Beckman DU650.
Inmunoprecipitación. La purificación por inmunopreci- pitación se llevó a cabo incubando 100 µg
de extractos proteicos (toda la noche a 4 oC y agitación constante) con el complejo perlas-anticuerpo
previamente ensamblados en
0.6 ml de PBS en tubos eppendorf de 1.5 ml. Los comple- jos formados fueron lavados 3 veces con 1
ml de PBS fres- co. El ensamblaje de los complejos perlas-anticuerpos se realizó incubando 3 µl de
perlas de agarosa y 500 ng de anticuerpo anti-REST en 0.6 ml de PBS durante 2 horas en agitación
constante.
Tinción con nitrato de plata. Después de la electrofore- sis, el gel fue lavado con agua mQ durante
10 min, y trata- do para su tinción con nitrato de plata como se describió previamente (Ortuño-Pineda
et al., 2012).
Western blot. Después de la separación de las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida
al 12%, estas
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Figura 2.- Perfiles de expresión y localización de REST en células H69, MRC5 y A549.
Experimentos de wes- tern blot usando fracciones nucleares, citoplásmicas y membranales de
las diferentes líneas celulares y el anti- cuerpo anti-REST (H-290). A) Análisis de las
fracciones celulares de la línea H69. B) Análisis de las fracciones celulares de las líneas
MRC5 y A549. En ambos casos actina y p53 fueron usados como controles citoplásmico y
nuclear, respectivamente. Abreviaturas: ExC (extracto citoplásmico), ExN (extracto
nuclear), ExM (extracto membranal). C) Tabla de las isoformas de REST encontradas en
células cancerosas H69.
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Figura 3. Expresión diferencial de REST y tREST en líneas celulares de diferentes
estadios del cáncer de pulmón. A) Western blot para tREST usando las fracciones
citoplásmicas de las líneas celulares MRC5, H1417 y H69. B) Western blot para REST
usando extractos totales de las líneas celulares MRC5, H1417 y H69. C) Electroforesis
en gel de poliacrilamida (12%) y tinción con azul de Coomasie de los productos de
inmunoprecipitación de REST a partir del medio de cultivo de células cancerosas. D)
Western blot de los productos de la inmunoprecipitación de REST a partir del medio de
cultivo de las células cancerosas. Como control se usó medio sin células.
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fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa y probadas con el anticuerpo anti-
REST (sc-25398, Santa Cruz Biotechonology). El revelado de la membrana se realizó
por quimioluminiscencia usando el kit Western blotting luminol reagent.
Resultados
Las células epiteliales normales presentan un perfil de expresión de REST
característico, que las distingue de los linajes de progenitores neuronales y de neuronas
maduras. Típicamente, las células epiteliales expresan niveles basa- les de REST para
reprimir genes neuronales, mientras que en progenitores neuronales y neuronas
maduras, se pierde la expresión de dicha proteína (Ballas et al., 2005). Algu- nas
isoformas truncas de REST son necesarias para la re- gulación del fenotipo neuronal
en neuronas maduras y otras se han detectado en diferentes tipos de cáncer (Palm et
al., 1999, Fuller et al., 2005, Westbrook et al., 2005, Lvet al., 2010, Ortuño-Pineda et
al., 2012). La figura 1 mues- tra las diferentes variantes de RNA y sus correspondientes
isoformas de proteínas detectadas en el ser humano (véase figura 1). Para evaluar la
expresión de las isoformas de REST en SCLC, así como su localización celular, realiza-
mos fraccionamiento celular y western blot de células H69 en confluencia. Como
controles se usaron células pulmona- res no cancerosas (MRC5) y de carcinoma de
células no pequeñas (A549). Los resultados mostraron la presencia de REST, tREST y
una potencial isoforma de REST de 16 kDa (REST 16K) en células H69 (véase figura
2a). Adicional- mente, dichos experimentos evidenciaron localización abe- rrante de
todas las isformas de REST observadas. REST tuvo una localización esencialmente
membranal, mientras que tREST y REST K16 fueron detectadas en citoplasma y la
fracción membranal, respectivamente (véanse figura 2a y 2c). En las líneas celulares
MRC5 y A549 solo la forma canónica de REST fue observada (véase figura 2b).
Interesantemente, el análisis de REST y tREST en las líneas ce- lulares
correspondientes a etapas tempranas (células H1417) y etapas avanzadas (células H69)
del SCLC, mos- tró una pérdida de la expresión de REST en células cance- rosas desde
etapas tempranas del cáncer (véanse figura 3a) y un ganancia en la expresión de la
isoforma tREST (véase figura 3b). Finalmente, los ensayos de inmunoprecipitación
para la búsqueda de isoformas de REST en el medio de cultivo de las diferentes líneas
celulares evidenciaron la presencia de tREST como productos de secreción de las
células H69 (véanse figuras 3c y 3d).
Discusión y conclusiones
A diferencia de otros trabajos en donde no se ha podido demostrar la presencia de
isoformas de REST, nosotros encontramos al menos tres isoformas: REST canónica,
tREST y una nueva isoforma de 16 kDa. Si bien es cierto que nuestros resultados deben
de confirmarse mediante espectrometría de masas, las isoformas aquí presentadas están
en concordancia con las variantes de mensajeros pre- viamente descritas (Ortuño-
Pineda et al., 2012). Nuestros hallazgos tienen implicaciones biológicas importantes:
A)
Es probable que la pérdida de la función de REST en células H69 que conllevan
al fenotipo neuronal se deba no solo a un cambio en la expresión de REST y sus isofor-
mas, sino también a un cambio en su localización celular. Al respecto, Ballas y
colaboradores (2005) mostraron que para que ocurra la transición de progenitores
neuronales a neuronas maduras, se requiere un cambio en la expresión de REST y sus
isoformas (Ballas et al., 2005).
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B)
Es probable que el cambio en la localización de REST y sus isoformas se deba
no solo a la carencia en sus señales de direccionamiento nuclear, sino también a su
interacción con otros factores nucleares. La localización citoplásmica de isoformas
truncas de REST en otros mode- los celulares es debida a la perdida de las señales de
locali- zación nuclear en sus dominios de dedos de zinc (Shimojo, 2006), mientras que
la localización citoplásmica de REST canónica solo se ha observado en la enfermedad
de Hun- tington, cuando esta es secuestrada por complejos proteicos (Zucchato, 2007),
y
C)
La expresión y localización aberrante de REST y sus isoformas constituyen una
herramienta de uso potencial en el diagnóstico del SCLC.
Agradecimientos
Este trabajo fue posible gracias al financiamiento in- terno de la UAGro.
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